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11/5/08

Lab Basics (3): Fotocopiando ácidos nucleicos (I)

En la entrada anterior de la serie vimos cómo obtener DNA (y RNA) a partir de material biológico (células en cultivo, sangre). Ahora que tenemos nuestras cadenas de DNA resuspendidas en un tubito con líquido, ¿qué es lo que podemos hacer con ellas?
Lamentablemente poco, porque ese material que hemos obtenido es el material genómico completo del individuo (poco práctico para trabajar), y además está poco concentrado. Lo más corriente es que a nosotros nos interese trabajar con una parte de la secuencia de ese genoma, ya sea en el gen o genes implicados en nuestra investigación o en otra región concreta no codificante.
Esa pretensión pudo convertirse en realidad a finales de los 70 cuando, aplicando en laboratorio los mecanismos de replicación del DNA inspirados en los que tienen lugar en la célula, se diseñó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para obtener ingentes cantidades del fragmento de secuencia deseado.

En la naturaleza y en el laboratorio se parte de lo mismo, pongamos de momento, ADN nuclear. Lo primero que en la célula ocurre para replicar ese material es separar ambas hebras de la molécula de ADN, mediante enzimas helicasas. Pero separar los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas de la cadena de DNA también se puede hacer a altas temperaturas, entre 90-98ºC (a más puentes de H que haya que romper, más temperatura). Esto se llama desnaturalización.

Una vez con las cadenas separadas, la síntesis de la nueva molécula, copia de la original, se produce en sentido 5'-3' de la cadena, y partiendo de un fragmento previo de cadena complementaria a la original que proporciona el extremo -OH 3' libre para ir añadiendo nucleótidos. Estos fragmentos en la célula los crea la primasa, y la síntesis de la cadena copia,la enzima polimerasa.

Esos pequeños oligonucleótidos inciales de cadena sencilla (cebadores, o primers) se crean en laboratorio y se pueden diseñar a mano o con softwares disponibles en internet y pedir a casas especializadas (unos 12 euros cada oligonucleótido de 20 pares de bases, que es lo más usual, así que cada pareja de complementarios te sale normalmente por menos de 25 euros). Se diseñan para que sean complementarios a un fragmento de la región de interés y sirvan de base para amplificar una y otra cadena de la molécula molde en ambos sentidos (en el esquema de abajo lo entenderéis mejor). Se entregan liofilizados y se preparan para utilizarlos a una concentración final de 10-20 picomoles por microlitro de reacción.
Para unirlos a la cadena que queramos copiar utilizamos también la temperatura: según la secuencia de cada oligo esta temperatura de hibridación varía entre 45-64 grados aproximadamente(entre 50-58ºC es lo más habitual). Como esta unión a las cadenas molde sólo se produce si ambas secuencias son prácticamente idénticas, nos aseguramos que sólo copiaremos la región que nosotros hayamos delimitado mediante el diseño de nuestros cebadores.

La síntesis de la cadena molde se la dejamos a polimerasas obtenidas de bacterias extremófilas, altamente resistentes y activas a las temperaturas a las que estamos maltratando el DNA, y que amplifican la cadena normalmente a 68-74ºC, según la polimerasa. Una unidad de enzima es aquella cantidad que convierte 1 mol de sustrato por segundo. La polimerasa se vende en tubos de 500 a 10000 unidades (500 unidades te pueden costar entre 65-120 euros) y se emplea una concentración final de 1 unidad por microlitro de reacción.
Estas enzimas necesitan para su funcionamiento iones bivalentes (magnesio normalmente), que se aporta en forma de cloruro agregado o no a un tampón o buffer que mantiene un pH adecuado para la reacción. El tampón y el magnesio se suele vender en kits junto con la polimerasa correspondiente. Y por supuesto, se necesitan nucleótidos (desoxinucleótidos trifosfato o dNTPs), los ladrillos necesarios para que la polimerasa pueda ir construyendo la nueva cadena copia.

Así pues necesitamos para la reacción una cantidad suficiente de DNA copia (50-100 ng es lo más usual), que mezclaremos en un tubo en condiciones de esterilidad para evitar mezclas con material genético foráneo con la pareja de oligonucleótidos, la polimerasa, su tampón y magnesio, nucleótidos y agua destilada estéril y sin nucleasas hasta un volumen final de 25-100 microlitros.

Fijaos que en un ciclo de amplificación que hemos descrito (desnaturalización, hibridación, síntesis) por cada molécula molde se obtienen dos moléculas nuevas (cada una con una cadena molde y otra copia). Mediante ciclos sucesivos de esta reacción podemos obtener 2 elevado a n moléculas de DNA del fragmento que a nosotros nos haya interesado, donde n es el número de ciclos (30-40 es lo más normal; más allá la cantidad de DNA producido no es exponencial por agotamiento de los productos de la reacción). Y con esas cantidades de DNA obtenido sí se puede trabajar.

Antaño todos estos cambios de temperatura necesarios para los ciclos de amplificación los realizaba un operario cambiando los tubos de unas cubetas calientes a otras. Afortunadamente enseguida se emplearon termocicladores, una especie de estufas con temporizador en las que se puede introducir los tubos y programar el tiempo que queramos que el termociclador caliente o enfríe para cada fase del ciclo. Un termociclador moderno básico ronda los 6000 euros, aunque los hay mucho más sofisticados.

Para la desnaturalización se suelen emplear pocos segundos (medio minuto o así); para la hibridación, 30-40 segundos deberían ser suficientes; el tiempo de síntesis depende de la longitud que nosotros queramos amplificar (delimitada por los oligonucleótidos diseñados): normalmente una polimerasa típica amplifica 1000 pares de bases en un minuto; se suelen añadir algunos minutos extras, fuera del ciclo, para que las cadenas dejadas a medias se acaben de sintetizar, y por último la reacción se para dejando los tubos a 4 grados.
O sea, que en una hora y media o dos horas obtienes 2 elevado a 35-40 moléculas de tu trozo de DNA deseado en un tubo (salvo la gente de la serie CSI, que lo obtiene en 1 minuto escaso por exigencias del guión).
La semana que viene complementaremos esta información con algunos otros detalles acerca de la PCR y lo que se hace después con los tubos de reacción acabada.

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