Lab Basics (2): Purificando la esencia

La semana pasada explicamos cómo se pueden mantener y criar células animales en cultivo sin demasiados problemas. Hoy explicaremos que a partir de dichas células, y de otros materiales biológicos, se puede destilar la esencia de un individuo: su material genético.

Obtener el DNA y el RNA de una muestra es el primer paso para desarrollar otras muchas técnicas: identificar el individuo, secuenciar o clonar un gen, y llevar a cabo otras indagaciones. El punto de partida es disponer de material biológico susceptible de contener material genético, lo que equivale decir a que sirve cualquier cosa que contenga células nucleadas.

Purificar DNA a partir de un poco de su saliva, raíz de un pelo, semen, etc, como solemos ver en las series de genética forense, no es la situación más óptima en los laboratorios de investigación porque purificar el material genético de una muestra tan pobre es más complicado y menos eficiente, y se necesita material específico más caro.

Para obtener realmente de forma sencilla, barata y cuantiosa lo mejor es partir de sangre (congelada o fresca) o células en cultivo, obtenidas a partir de una biopsia como explicamos la semana anterior. En el caso de la sangre, las células nucleadas son las células del sistema inmunitario que circulan por la sangre: los glóbulos rojos y plaquetas deben ser descartados por centrifugación. En el caso de la biopsia, suele ser de piel y no hay problemas para obtener células con núcleo. Si se trata de células bacterianas, las bacterias deben haber crecido flotando en un tubo con medio líquido, y nos ahorramos el tener que acceder dentro de un núcleo.

Al centrifugar las células (tantas como podamos disponer) y quitarles el medio de cultivo quedan reducidas a un grumo de pequeño tamaño (pellet). Como lo que nos interesa (el material genético) está en el núcleo, debemos llegar hasta él. Para ello rompemos la membrana exterior de las células con soluciones alcalinas que contienen detergentes que "lisan" las células, centrifugamos para descartar esa basurilla y rompemos la membrana de los núcleos que andan por ahí sueltos con una solución similar. Así, todas las "tripas" de las células quedan sueltas en el tubo.

Como normalmente nos interesa obtener el DNA y el otro ácido nucleico que está por ahí pululando (el RNA) nos interfiere, nos lo cargamos añadiendo una solución que contiene unas enzimas que se cargan el RNA (ribonucleasas, o RNAsas). Después de dejarlas actuar (a 37ºC como casi todas las enzimas que funcionan en el cuerpo), debemos librarnos de lo siguiente que nos molesta en nuestro batiburrillo: las numerosísimas proteínas que formaban parte de la célula. Podemos conseguir que precipiten en forma de mucosidad blanca y densa añadiendo una solución alcalina, a menudo acompañada de otras sustancias que rompen la estructura proteica. Tras centrifugar, el pellet contendrá el material de desecho "pesado" (restos de membranas, proteínas, guarreridas) y en la fracción líquida, lo que nos interesa, el DNA en restos líquidos, que se traslada a un tubo limpio.

Para seguir limpiando ese DNA de sales y guarreridas lo tratamos de forma secuencial con alcoholes de distinto tipo: isopropanol, y etanol de más a menos concentrado, que hace que la molécula de DNA precipite en forma de hebras blancas que pueden ser visibles incluso a simple vista. Centrifugando y haciendo evaporar el etanol, obtenemos dichas hebras aisladas, que conservaremos resuspendidas en agua destilada pura y estéril u otro tampón de conservación, en la nevera o un congelador. El aspecto no es más que un pequeño tubo con una ínfima cantidad de líquido transparente dentro, pero esconde la información genética de un individuo entero.
Todas estas soluciones y materiales pueden comprarse sin problemas como kits de purificación, que contienen todo el material e instrucciones necesarias para 50 o 100 reacciones y suelen pasar de los 100 euros.

Cuando se necesita un DNA extraordinariamente purificado se suele intercalar un paso extra, que es el de hacer pasar la mezcla líquida obtenida a partir del lisado de núcleos por una cilindrito de plástico que contiene una membrana especial de silicagel, que tiene la propiedad de retener el DNA y dejar pasar las demás porquerías. Los lavados con etanoles pueden seguir produciéndose sin que el DNA se separe de dicha columnita. Después, con simple agua o tampón podemos eluir el DNA hasta el tubo definitivo. Gracias a ese paso por la columna de purificación la muestra resultante es mucho más pura y nos aseguramos que queden menos restos.

El caso de RNA es bastante más complicado, porque es un ácido nucleico que se degrada con mirarlo y requiere más miramientos. Se debe partir de sangre fresca (recién obtenida y sin coagular) o cultivo fresco. La lisis celular y solubilidad del RNA se lleva a cabo con sales de guanidina, detergentes y soluciones reductoras que se cargan las proteínas e inhiben las RNAsas además de promover que el RNA se una a la columna de purificación. La contaminacion por DNA puede resolverse mediante enzimas DNAsas o se pierde con el resto de impurezas. Usaremos guantes y material tratado especialmente para que las RNAsas presentes por doquier no interfieran.

Estos protocolos básicos pueden aún ser modificados a fin de garantizar más pureza o mejorar la eficiencia de purificación. ¿Cómo comprobar el estado del material genético obtenido y qué otras manipulaciones podemos llevar a cabo? Eso lo veremos en los siguientes capítulos de la serie...