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11/10/08

Lab Basics (5): Analizando secuencias

¡Perdón por la tardanza! No os penséis que íbamos a dejar sin terminar la serie divulgativa. Habíamos dejado las muestras de ADN congeladas a -20ºC grados una temporadita, y ahora podemos continuar trabajando con ellas.
Por si no os acordáis, en nuestra entrada anterior, habíamos explicado cómo obtener muchas copias de una región concreta del ADN a partir de una muestra mucho menos concentrada, gracias a la técnica de la PCR.
Lo normal, cuando uno manipula secuencias de ADN (amplificándolas, o cortándolas, como veremos en una entrada posterior), es que le quede el resquemor de si la secuencia resultante se ha mantenido idéntica a la original, sin que se haya introducido o perdido algún nucleótido en alguna de las reacciones, o las enzimas polimerasas se hayan equivocado a la hora de copiar la cadena de origen. A veces es lo contrario: hemos amplificado una secuencia con unos cebadores que pretendían introducir cierto nucleótido mutado a nuestra conveniencia y queremos saber si realmente ese cambio deseado está en las moléculas hijas.
Para asegurarnos de que nuestra secuencia es la deseada, recurrimos a la técnica de la secuenciación.
Actualmente, esta técnica consiste en realizar una amplificación por PCR en un termociclador normal, partiendo de una cierta cantidad del ADN que se desea "leer", una polimerasa especial y una mezcla de nucleótidos modificados, algunos de los cuales están unidos marcados con fluorescencia (o terminadores): cada uno de ellos (A, T, C, G) marcados con una fluorescencia distinta. En esta reacción de amplificación, a diferencia de las habituales, no se utiliza una pareja de cebadores para seleccionar la región concreta que se desea amplificar, si no sólo uno de los cebadores (mejor si en un tubo se utiliza el cebador complementario a una de las cadenas, y en otro, el complementario a la cadena contraria, para así comprobar que los resultados de ambas son equivalentes).
El cebador se une a la región complementaria y la polimerasa empieza a amplificar esa región de interés. Cuando incorpora uno de los nucleótidos marcados, no puede seguir elongando esa cadena y l asecuencia queda truncada. De forma ideal, al final del proceso tendremos tantas cadenas de tamaño escalonado como bases nucleotídicas teníamos en la cadena que queríamos copiar.
El protocolo de tiempos y ciclos es algo diferente al de la PCR normal, pero base del proceso es la misma.
Una vez hecho eso, se precipitan y limpian las muestras obtenidas de la PCR para eliminar sales y restos de terminadoes; esto puede hacerse limpiando el ADN con etanoles a diferente concentración o filtrarlo con unas resinas especiales. Una vez limpio y resuspendido convenientemente, se hace pasar por un secuenciador.
Este equipamiento no suele estar disponible en los laboratorios al uso, así que es frecuente llevar las muestras a una unidad especializada que cobra por hacerlo. Allí disponen de robots secuenciadores automáticos que pueden secuenciar muchas muestras de una sola vez: separan las moléculas de ADN por tamaño tras pasarlas por un capilar y detectan la fluorescencia que emite el último nucleótido incorporado. Después registran el resultado en forma de gráfico de picos de colores (convencionalmente, T rojo, G negro, C azul y A verde), llamados cromatogramas, de manera que viendo la sucesión de picos se puede leer la secuencia que ha pasado por el capilar (existen programas informáticos específicos).


Arriba: Dos figuras esquematizando el proceso general de secuenciación automática.
Abajo: cromatograma y detalle de una secuencia de picos.

Mediante otro tipo de softwares, comparamos esa secuencia obtenida con la secuencia de referencia, que es la que queríamos obtener. Asi podemos detectar incongruencias entre ambas secuencias, detectar errores, comprobar si se han introducido los cambios que queríamos, etc.
La longitud máxima de una secuencia que se puede leer bien, sin que los picos salgan deformados, suele ser de hasta 1500 pares de bases.
Por ejemplo, queremos buscar mutaciones en cierto gen, responsables de una enfermedad hereditaria en un paciente. Obtenemos ADN genómico del paciente, amplificamos en diferentes fragmentos todo el gen por PCR y secuenciamos esos fragmentos. En uno de los cromatogramas correspondiente a uno de esos fragmentos, vemos un cambio de una A por una G respecto a la secuencia de referencia: en esa posición hay dos picos porque la mutación se encontraría en heterozigosis, es decir: en uno de los cromosomas la secuencia es correcta; en el otro, está presente esta variación. Normalmente estos cambios se traducen también en cambios a nivel de proteína. Mutación habemus.

3 comentarios:

Anónimo dijo...

Me alegro que vayas a terminar tu serie divulgativa. Es muy interesante.

diana laura dijo...

HOLA ELENA, HACE TIEMPO VI LA PAGINA Y LA PERDI HOY QUE LA ENCUENTRO NO ME HE LEVANDADO HASTA LEER TODO LO QUE HAZ PUESTO, ME ENCANTO ESTA FACILISIMO DE ENTENDER TODO POR LA AGILIDAD COMO LO EXPLICAS, GRACIAS

TE SALUDO DESDE OAXACA MEXICO
NO DEJES DE SEGUIR ESCRIBIENDO SEGIRE CON ALEGRIA TUS COMENTARIOS

Elena dijo...

Muchas gracias, Diana Laura. La idea de la serie era sacrificar un poco de rigor para que las explicaciones fuesen relativamente cortas y fáciles de entender.
Gracias por seguir el blog!