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6/11/08

Lab Basics (7): Clichando biomoléculas (II)

En la entrada anterior vimos que al ADN puede separarse por tamaño y avanzamos que esa misma estrategia (electroforesis) puede utilizarse para separar e identificar otra clase de biomoléculas.

Antes de meternos en harina debemos comentar otra técnica de gran uso para detectar la presencia de cierto fragmento de ADN concreto en medio de muchos otros. Tras una electroforesis como la que hemos explicado, en la que hayamos provocado que las moléculas de ADN se separen por tamaño, se puede transferir el ADN desde el gel de electroforesis hasta una membrana de nitrocelulosa o nylon acondicionada para tal fin...: gel y membrana se ponen en contacto, formando un sandwich entre capas de papel de filtro, encargadas de absorver un tampón iónico por capilaridad y hacer que el ADN abandone el gel y se quede enganchado a la membrana.
Ponemos esa membrana en contacto con un líquido que contenga algo que se una a ese ADN deseado, que evidentemente será una secuencia complementaria a la que llamaremos sonda, y cuyos nucleótidos estarán marcados de alguna manera para que después nos revelen su posición (con isótopos radiactivos, por ejemplo. Después podemos exponer esa membrana a un film de fotografía en una cámara oscura, quedando grabado en el film un patrón de bandas que después analizaremos, en busca de nuestro fragmento deseado.



Esa técnica la desarrolló un tal Edwin Southern y pasó a popularizarse como Southern blot. Rápidamente se aplicó esa misma estrategia a la detección de ARN: como los científicos son unos cachondos, seguieron con los puntos cardinales y llamaron a esta técnica Northern blot. Se utiliza sobre todo para averiguar si se encuentra el ARN derivado de la expresión de cierto gen en muchos tipos diferentes de tejidos.

ADN, ARN, y faltan las proteínas para completar la santísima trinidad.

Las proteínas se sacan a porrillo rompiendo las células: se aplica una electroforesis en un gel especial que contenga una sustancia desnaturalizante que rompa la estructura tridimensional de las proteínas y las reduzca a la forma de cadenas de aminoácidos: las miles de proteínas presentes en la célula se distribuirán por tamaño. Para esto no nos sirve una matriz de agarosa: se requiere un gel de acrilamida y unas cubetas de electroforesis especiales.



Las proteínas se pueden poner de manifiesto tiñendo ese gel con colorantes que se fijan a las proteínas, como el Coomassie. Las proteínas más abundantes en la mezcla darán lugar a bandas de mayor intensidad.



Esas proteínas se traspasan a una membrana, que se incuba con un anticuerpo específico que actúe de post-it natural y reconozca nuestra proteína querida y ninguna otra (para evitar uniones inespecíficas, las membranas se bloquean con alguna solución; en este caso suele ser leche, para que las proteínas de la leche se unan a todas las regiones libres de la membrana y se evite que los anticuerpos se unan a lo loco). Normalmente es necesario retirar el exceso de anticuerpos mediante lavados y volver a incubar la membrana con otro anticuerpo, conjugado con alguna molécula de la cual podamos obtener alguna reacción bioquímica que se pueda detectar (fluorescencia es lo más común). En una cámara oscura se puede obtener una impresión de esa fluorescencia en un film. Para continuar con el chiste, a esto se le llama Western blot.

Por ejemplo, la imagen que sigue corresponde a un western blot real. En el primer carril se ven las bandas correspondientes a una proteína normal (hay dos bandas porque la proteína tiene dos formas de procesamiento distintas, de tamaño diferente). Los demás carriles corresponden a esa misma proteína pero con mutaciones puntuales. El último carril corresponde a esa proteína mutada con una deleción de un fragmento: vemos que el tamaño de las bandas, por tanto, es más pequeño.
La intensidad relativa de las bandas se puede cuantificar, para hacer un cálculo aproximado de la cantidad de proteína a la que corresponde.



Y no existe Eastern blot porque la tríada ADN-ARN-proteína ya está cubierta (a no ser que a la Reina se le ocurra algún otro participante en el origen de la vida).

Todas estas técnicas parecen fáciles de explicar, pero obtener buenos resultados con ellas es francamente dificil y requieren dos dias de trabajo, e incluso más. Lo que hemos explicado aquí es apenas un bosquejo del procedimiento completo. Además son técnicas caras. Existen, por supuesto, derivaciones de estas técnicas, y mucho otros procesos similares de gran importancia, pero es imposible detallarlos todos.

Trabajo duro y delicado para poder poner de manifiesto lo tremendamente pequeño e invisible.
Quiero rendir un sentido homenaje a todos esos científicos (formados y en formación) que trabajan duramente en estas técnicas ante la incomprensión de la población general, a la que mencionas que no te salen los western y piensan en algo como esto:

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