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7/1/09

Lab Basics (10): Pinta y colorea (células)

Finalizamos esta serie de divulgación explicando una de las técnicas más espectaculares que se aplican en biología molecular: la microscopía por fluorescencia, o cómo distinguir las diferentes partes de la célula o localizar proteínas o trozos de secuencia marcándolas con colores.

La técnica más corriente es la de inmunofluorescencia, o marcaje por anticuerpos. Las células en cultivo pueden inmobilizarse fijándolas con metanol o paraformaldehído al portaobjetos de microscopía donde se han dejado crecer, o dejarlas vivas y funcionando en placas especiales que permitirán realizar las labores de microscopía respetando las necesidades ambientales de la célula. Hacer perrerías a las células mientras las mantienes vivas es difícil puesto hay que conservar las condiciones óptimas de pH, temperatura, intercambio de gases...mientras lucen ante las cámaras. Por eso lo más habitual es fijarlas con una solución que mantenga fija sus estructura y las deje "congeladas". A continuación se aplican tratamientos de permeabilización de la membrana para que entren los anticuerpos.

Marcando con anticuerpos proteínas específicas de cada orgánulo celular o utilizando otras moléculas que se unen a proteínas o lípidos, podemos localizar todos los compartimentos de la célula: membrana, mitocondrias, retículo endoplasmático...así como localizar nuestra proteína de interés (podemos saber si está repartida por todo el citoplasma, se concentra en el núcleo, se localiza en la membrana...etc).
Los anticuerpos se producen en animales de granja (rata, ratón, oveja, cabra, y a veces pollo, caballo, burro...) inyectando la proteína exógena y desangrando posteriormente el animal. Normalmente de usa primero un anticuerpo que detecta la proteína y después un anticuerpo secundario que detecta al primero y que está unido a una moléclula que emite fluorescencia (fluoróforo). Una batería de anticuerpos secundarios con diferente marcaje, desarrollados en animales diferentes a los del anticuerpo primario, forma parte de la equipación de cualquier microscopista.

En la siguiente imagen casera, el núcleo celular está teñido con DAPI (emite fluorescencia en el espectro del azul), los lisosomas están detectados con un anticuerpo conjugado con un fluoróforo en verde y el retículo endoplasmático, marcado en rojo.



Es importante que los espectros de fluorescencia de las diferentes regiones marcadas no se solapen (un marcaje debe ser en el espectro del verde y otro en el del rojo, por ejemplo). La colocalización de una proteína marcada con un color con un orgánulo marcado con otro color se pone de manifiesto por el color de la fluorescencia resultante (por ejemplo, si rojo y verde colocalizan se percibe fluorescencia amarilla).



Las mismas técnicas se pueden aplicar en cortes de tejido.



Otra alternativa, en vez de preocuparnos de los anticuerpos, es fusionar la proteína de interés a otra que emita fluorescencia, como ya anticipamos en una entrada anterior. Es el caso de las famosas proteínas de fusión derivadas de la Green Fluorescent Protein (GFP), obtenida a partir de una medusa que emite de forma natural fluorecencia y que por mutagénesis ha permitido desarrollar variantes de diferentes colores (roja, amarilla, azul...). Transfectando las células con dicho vector, fabricarán nuestra proteína de interés que llevará colgando el pequeño farolillo de la proteína fluorescente, lo cual nos permitirá también localizar su posición o valorar la interacción con otras proteínas. Fijaós si es importante esta técnica que los investigadores que la desarrollaron ganaron el Premio Nobel de Química en 2008.

También se puede añadir a nuestra proteína de interés cualquier otra secuencia contra la cual podamos dirigir un anticuerpo o alguna molécula que reaccione y permita su detección. En definitiva, lo que queremos es utilizar la ingeniería genética o el marcaje natural por anticuerpos para ponerle un banderín detectable a nuestra proteína.

Por último, mediante sondas (secuencias de ADN complementarias a nuestra secuencia de interés) fluorescentes o radiactivas, podemos localizar nuestro gen en un conjunto de cromosomas. Una aplicación típica es la detección de trisomías a nivel prenatal(si hay tres puntos de color en vez de dos, es que tenemos una copia extra de ese gen!).



Y aconsejando un paseo por alguna galería de imágenes de microscopía profesionales para descubrir lo que dan de sí estas técnicas, concluimos nuestra serie de diez entradas resumidas que pretendían explicar, de forma superficial, algunas de las técnicas más comunes y utilizadas en los laboratorios de biología molecular. Tras la somera descripción se esconden técnicas caras y largas de realizar, que a menudo entrañan dificultades técnicas nada desdeñables, pero que en todo caso son de común aplicación y conocidas por la mayor parte de científicos. Sirva esto como acercamiento a una profesión sumamente desconocida, compleja, frustrante y a la vez sumamente creativa y gratificante (¡¡cuando tu esfuerzo se traduce en el resultado esperado!!).

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