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31/10/08

Lab Basics (6): Clichando biomoléculas (I)

Cualquier persona curiosa que esté un poco interesada en la biología molecular puede llegarse a preguntar...¿cómo saben los científicos si en un tubito hay ADN, si no se ve a simple vista ni con los microscopios más sencillos, y en ese tubo no parece haber más que agua? Y después de haber explicado técnicas como la de la PCR, ¿cómo podemos saber, si no vemos nada a simple vista, que tenemos millones de copias del fragmento que queremos y de ningún otro?
Pues es porque, aunque parezca mentira, es la mar de fácil separar el ADN por tamaño y detectarlo aprovechando algunas particularidades químicas de esta molécula tan amigable.

Recordad que la molécula de ADN está compuesta por un esqueleto de azúcares pentosa, grupos fosfato y una sucesión de bases nitrogenadas (componentes de los nucleótidos). La carga del ión fosfato es negativa. Eso significa que, como quien no quiere la cosa, la carga eléctrica global de la molécula de ADN es negativa. Si ese dato lo relacionáis con lo que os explicaron en la escuela sobre campos eléctricos, deduciréis que si sometéis al ADN a un campo eléctrico, por un fenómeno de repulsión la molécula se desplazará a la zona positiva del campo.
Recordad también el dato de que el ADN tiene una estructura algo rígida de doble cadena.
Si introducimos al ADN en una matriz porosa, que será el soporte que someteremos al campo eléctrico, la molécula se moverá con más o menos facilidad en función de su longitud total, el tamaño del poro de la matriz y el voltaje del campo eléctrico. Es decir, que tenemos una serie de variables para discriminar el tamaño de una molécula de ADN. Es lo que se conoce como técnica de electroforesis.

La matriz porosa a la que nos referimos se forma con agarosa (un polvo extraído de algas) disuelta en cierto volumen de una solución salina (que proveerá los iones necesarios para que exista el campo eléctrico), calentada y posteriormente solidificada: según el % final de agarosa (normalmente 0,8-2,5% por ciento) tendremos una matriz sólida de un polímero con un tamaño mayor o menor de poro. A menor tamaño de poro, mejor discriminaremos fragmentos pequeños de ADN, que se irán repartiendo por la matriz en función de su longitud pues a mismo voltaje eléctrico, los fragmentos cortos se desplazarán más rápido hacia el polo positivo y los fragmentos largos quedarán retenidos. Si necesitamos un tamaño de poro mucho menor, la agarosa no nos sirve pero contamos con otro polímero, la acrilamida.



Para poder introducir el ADN en la matriz o gel, se hace polimerizar o solidificar la matriz con un peine que fabrica unos pequeños pocillos en uno de los lados: allí se cargará un cierto volumen de nuestra dilución de ADN mezclado con glicerol (que hará que el ADN pese y caiga al fondo del pocillo) y unos colorantes azules que también se desplazarán por el gel y nos avisarán de si todo funciona bien y de cuándo las moléculas corren el riesgo de salirse de la matriz por el otro lado como si de un barco vikingo al llegar al final del mundo se tratara.



La matriz de agarosa se introduce en una cubeta llena del tampón iónico: esta cubeta tiene un borne negativo y otro positivo: las muestras de ADN se cargan en el lado negativo para que recorran la matriz hacia el lado positivo. La cubeta se conecta a una fuente de voltaje (70-120 V usualmente) durante un tiempo determinado (30 minutos o incluso horas) en función del tamaño previsto de nuestros fragmentos de ADN.



Una vez pensamos que los fragmentos de ADN ya han podido distribuirse por la matriz, se detiene la electroforesis y se puede detectar el ADN gracias a una molécula que se intercale entre las dos cadenas (presente en la mezcla de carga o sumergiendo la matriz en ella): habitualmente suele ser bromuro de etidio pero existen alternativas menos peligrosas (el bromuro de etidio también se intercala en NUESTRAS cadenas de ADN y es por ello que todo el material en contacto con bromuro de etidio queda fatalmente marcado como potencialmente cancerígeno).
Al incidir la luz UV en el bromuro (con unos aparatos llamados transiluminadores) , despide fluorescencia rosada. Esto es lo que podemos descubrir al iluminar con UV una matriz de agarosa después de la electroforesis:



De lo cual podemos hacer una foto o sacar una imagen:



El primer carril responde a un marcador de peso molecular, esto es: una mezcla de fragmentos de ADN de tamaño conocido, que nos sirven como referencia. Los siguientes carriles corresponden a las muestras que queríamos comprobar. Imaginad que habíamos querido amplificar por PCR un fragmento de cierto gen a partir de muestras de 6 personas diferentes. Hay ocho tubos porque uno de ellos nos ha servido como control negativo, esto es, una mezcla de PCR sin ADN para comprobar que no existe contaminación y que amplificamos sólo el ADN que introduzcamos en el tubo. Al hacer una electroforesis tras la PCR, cargando el marcador y las ocho muestras de izquierda a derecha, podemos concluir que:
a) Nuestra PCR no se ha contaminado.
b) Hemos amplificado el fragmento que queremos y ningún otro (porque comparando con las bandas del marcador, el fragmento que sale marcado en los carriles tienen el tamaño que nosotros queríamos). ¡¡¡Si viéramos bandas extrañas de otros tamaños, sabríamos que no tenemos nuestro ADN amplificado suficientemente purificado!!!
c)El ADN de la persona correspondiente al carril número 2 no se ha amplificado: algo falló en esa reacción. ¿ADN en mal estado? ¿Error en el proceso?
d)El ADN de la persona correspondiente al carril número 4 no se ha amplificado tanto como las demás, hay menos concentración, porque a igual volumen cargado, la banda tiene menos intensidad. ¿ADN en mal estado? ¿Mal cuantificado? ¿Error en el proceso?

Como veis, podemos extraer bastante información.

La banda de agarosa con ADN dentro se puede recortar, recalentar, separar el ADN de la agarosa y purificar el ADN, por si queremos recuperar nuestro fragmento favorito y purificarlo, para secuenciar, por ejemplo.
Distintas variantes de la electroforesis se pueden aplicar para separar fragmentos de ADN
con distinto fin, pero no las detallaremos todas. En la siguiente entrega, sin embargo, veremos que la misma filosofía se puede utilizar para separar proteínas y ARN, con otra serie de técnicas tan universales que merecen una entrada aparte.

2 comentarios:

sonicando.com dijo...

Muy bien explicado un "pan nuestro de cada día"...

Otro día os toca meteros con la acrilamida, y así ve la gente como "vemos" las proteínas...y de ahí al western-blot es un pasito...

Gran Entrada..

Salva dijo...

Sí señor! Gran explicación, Elena!